Protocol

1. 准备ES细胞到matrigel plate，去除MEFs

► 准备1:3 matrigel plate：冰上预冷TC 培养板和移液管，冰箱或者冰上解冻1:3 matrigel。小心把matrigel包被在板子上且保证覆盖底部，然后吸出多余的matrigel（在包被 matrigel过程中保持所有东西预冷）。把matrigel plates放在冰上30 min。再次吸出多余的matrigel并把包被matrigel的板子37◦C孵育30 min。

► 37◦C TrypLE处理融合的ES细胞2-3 min（10 cm dish用4ml TrypLE或者6孔板的每孔1ml），然后吸出TrypLE。用wash media (IMDM + Glu + P/S + 0.1%BSA) 洗2-3次。10 cm dish加4ml hES media或者6孔板的每孔1ml，用细胞刮棒刮去板子底部的ES细胞。上下吹打3-5次，显微镜下观察直到可以得到5-10个细胞团。

► 接种细胞到matrigel-coated板子上

2. 设置T0：5% O2, 5% CO2条件下，当有70-80%融合时，细胞会发生分化。用wash media洗细胞2次并添加适量体积T0 培养基（如10cm dish加10ml，6孔板的每孔2ml）

3. 用wash media洗细胞并且每天更换培养基直到T5。前几天看到大细胞死亡是正常现象。

4. 进入肝分化，用Accutase 37◦C 3min分离T5细胞，wash media洗细胞两次。6孔板的每孔加入1ml wash media并刮下细胞。收集T5细胞，1200 rpm离心3min。用T5 media重悬细胞并且以1:6接种细胞到matrigel-coated 6孔板，250K cells/well。

5. 每2天用不同分化培养基接种细胞（如下），并在18-25天收集用于分析。

注：matrigel的每批内毒素水平和蛋白浓度都有差异，建议内毒素水平不高于2 units/mL，蛋白水平应在7-10mg/mL之间。如果蛋白水平较高，可能要多于1:1稀释，这取决于hESC克隆形态和hESC分化为需要系别的能力。操作matrigel过程中，所有管子、培养板和移液器都必须是预冷的，matrigel室温下回凝固。

附：

1) hES Media (500 ml)

DMEM/F12: 400 ml

KOSR: 100 ml

NEAA: 5 ml

L-glutamine: 5 ml

Pen/strep: 5 ml

β-Mercaptoethanol: 3.5 ul

bFGF: 10 ng/ml (50 ul of 100 ug/ml 贮存)

L-Ascorbic Acid: 50 ug/ml –每次培养基更换加新鲜的5 mg/ml贮存液

2) 分化培养基：

(3) 肝分化培养基:
 

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