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如何用淋巴细胞分离液分离单个核细胞?

点击次数:1495 次    更新时间:2017-06-01

如何用淋巴细胞分离液分离单个核细胞?


如何用淋巴细胞分离液分离单个核细胞?


1)分离外周血中的单个核细胞(PBMC)


1.抽取正常人静脉血加到肝素抗凝管中,加等量含5~10IU/ml肝素的无血清缓冲液悬浮细胞。将细胞悬液小心加在与血液等量的淋巴细胞分离液上,室温中,水平离心500×g 20分钟。此时离心管中形成5层:最上面是血浆,血浆层和淋巴细胞分离液之间是PBMC,淋巴细胞分离液层和最下面的红细胞层之间是粒细胞层,又成为棕黃层。


2.吸去最上层的血浆,收集血浆层和淋巴细胞分离液交界面的单个核细胞,尽量全部吸出PBMC。加1~2倍量含5IU/ml肝素、2%灭活小牛血清的Hanks液(洗涤液),混匀后离心200×g 10分钟,低速离心有利于去除细胞悬液中留存的血小板,去上清液。


3.再用同样洗涤液洗涤细胞2次,每次离心500×g 10分钟,洗去残留的淋巴细胞分离液。用1%台盼蓝染色检测细胞活力(应>95%)并计数细胞。再用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。通常,每毫升外周血可得1×106~2×106PBMC。


2)分离关节滑液中的单个核细胞


1.将关节滑液置含肝素(终浓度5IU/ml)的离心管中,离心1000×g 15分钟。


2.用含2%灭活小牛血清的Hanks液悬浮沉淀细胞并洗涤细胞1次,每次离心1000×g 15分钟。用含2%灭活小牛血清的Hanks液悬浮细胞至原容量。


3.用淋巴细胞分离液分离关节滑液中的单个核细胞,并用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。


3)分离组织中的单个核细胞


1.取外科分离的各种组织,用含1%庆大霉素和1%小牛血清的MEM培养液洗涤组织块,洗去可能的污染物。将组织块置培养皿中,加入约为组织块体积5~10倍的同样MEM培养液。用无菌外科剪刀将组织块剪碎成0.5mm3大小。


2.将组织块转移到小培养瓶中,静置片刻,吸去培养液。加入约2倍组织块体积的、滤过除菌的酶溶液。37℃水浴摇床中消化1~2小时,注意组织块的消化程度。


3.当组织块消化分散后,用手用力摇晃培养瓶3~5分钟或用大口吸管反复吹打,使细胞团进一步分散。加入30ml上述MEM培养液,终止酶反应。


4.让上述悬液通过200目的金属网或尼龙网,分离单个细胞。用上述MEM培养液洗涤细胞3次,每次离心1000×g 10分钟。用1%台盼蓝染色法检测细胞活力并计数细胞。


5.如果细胞量较多(>107),应当用上述淋巴细胞分离液分离出单个核细胞,并用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。


4)从小鼠胸腺中分离胸腺细胞



1.脱臼或剪头处死小鼠,置75%乙醇中浸泡消毒。腹面向上固定,剪开小鼠胸腔,暴露和摘取胸腺。在平皿中用Hanks液洗净血液,去除结缔组织。


2.在有少量细胞培养液的平皿中,用镊子梳理胸腺,再用大口吸管反复吹打,分离单个细胞。离心沉淀细胞,用细胞培养液洗涤细胞1次。加入适量细胞培养液,静置5分钟,让大的组织块自然沉降,吸出单个胸腺细胞。


3.用1%台盼蓝染色法检测细胞活力,计数细胞。再用含10%小牛血清的细胞培养液将细胞配成适当浓度。

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