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啥都能用多聚甲醛固定吗?

点击次数:1461 次    更新时间:2017-07-25

啥都能用多聚甲醛固定吗?

作者:联科生物    发布日期:2017-07-19 09:00

多聚甲醛,胞内染色,细胞固定,抗体染色.裂解全血


我们实验中,标本中大多数神经激素、肽类物质,以及蛋白质为水溶性,在用于研究之前,常需固定,即使其凝固以降低其水溶性。甲醛能与蛋白质的氨基反应,使蛋白质凝固,因此在医药上可做检验时的组织固定剂、以及防腐剂等。而在固定剂中,最常用的是多聚甲醛。


多聚甲醛染色前固定


做实验的过程中,因为排不上实验仪器、希望标本能够较长时间存放等等原因,很多实验人员习惯性都会用4%多聚甲醛预先固定标本。也有为了灭活标本里面可能存在的微生物(细菌、病毒等),起到安全保障作用;或者是做胞内染色前的准备,进行固定细胞 。


然而,可能很多人忽视了一点,就是如果在染色之前用多聚甲醛固定标本,细胞表面有些位点在固定后构象发生改变,使得抗体无法结合产生假阴性,也可能由于固定作用,导致其它位点产生非特异性结合(假阳性)。


因此,知道哪些抗体染色前不能预固定,十分重要。贴心的技术人员帮我们做了一系列测试,下面两张表,可以看的出来,大多数不能固定的抗体都是趋化因子受体类目的,这类抗体,大家在实验中要注意不能先固定后染色。


—— 人源样本——
 

实验样本
克隆号
标记物
 是否适合固定
裂解全血, 淋巴细胞
L263G8
CCR8
No
裂解全血, 淋巴细胞
1712380
CCR10
No
裂解全血, 淋巴细胞
UCHT1
CD3
Yes
裂解全血
OKT3
CD3
Yes
裂解全血
HIT3a
CD3
Yes
裂解全血
SK7
CD3
Yes
裂解全血
OKT4
CD4
Yes
裂解全血
RPA-T4
CD4
Yes
裂解全血
UCHT2
CD5
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
BL-CD6
CD6
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
CD7-6B7
CD7
Yes
裂解全血
RPA-T8
CD8
Yes
裂解全血
HIT8a
CD8
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
HI111
CD11a
Yes
裂解全血
ICRF44
CD11b
Yes
裂解全血, 单核细胞
3.9
CD11c
No
裂解全血
WM15
CD13
Yes
裂解全血, 单核细胞
M5E2
CD14
Yes
裂解全血
HCD14
CD14
Yes
裂解全血
W6D3
CD15
Yes
裂解全血, 粒细胞
HI98
CD15
Yes
裂解全血
3G8
CD16
Yes
裂解全血
TS1/18
CD18
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
HIB19
CD19
Yes
裂解全血
EBVCS-5
CD23
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
ML5
CD24
No
裂解全血
BC96
CD25
No
裂解全血
O323
CD27
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
M-T271
CD27
Yes
裂解全血
CD28.2
CD28
Yes
裂解全血
WM59
CD31
Yes
裂解全血
581
CD34
No
裂解全血
HIT2
CD38
Yes
裂解全血
5C3
CD40
Yes
裂解全血
HI30
CD45
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
CC2C6
CD47
Yes
裂解全血
CBR-IC3/1
CD50
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
MEM-188
CD56
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
HCD56
CD56
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
DREG-56
CD62L
Yes
裂解全血, 单核细胞
IT2.2
CD86
Yes
裂解全血, 粒细胞
S5/1
CD88
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
DX2
CD95
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
HCD99
CD99
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
A019D5
CD127 (IL-7Rα)
No
裂解全血
Ber-ACT35
CD134
No
裂解全血
SE5A5
CD172a/b
Yes
裂解全血
LSB2.20
CD172g
Yes
裂解全血, 粒细胞. 淋巴细胞
8F1/CXCR1
CD181 (CXCR1)
No
裂解全血, 粒细胞
5E8/CXCR2
CD182 (CXCR2)
No
裂解全血, 淋巴细胞
G025H7
CD183 (CXCR3)
No
裂解全血, 淋巴细胞
12G5
CD184 (CXCR4)
Yes
裂解全血, 粒细胞
500000000
CD193 (CCR3)
No
裂解全血, 淋巴细胞
L291H4
CD194 (CCR4)
No
裂解全血, 淋巴细胞
T21/8
CD195 (CCR5)
No
裂解全血, 淋巴细胞
HEK/1/85a
CD195 (CCR5)
No
裂解全血, 淋巴细胞
J418F1
CD195 (CCR5)
No
裂解全血, 淋巴细胞
G034E3
CD196 (CCR6)
No
裂解全血, 淋巴细胞
G043H7
CD197 (CCR7)
No
裂解全血, 淋巴细胞
L053E8
CD199 (CCR9)
No
裂解全血
C1.7
CD244 (2B4)
Yes
裂解全血
11C1
CD268 (BAFF-R)
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
EH12.2H7
CD279
No
裂解全血
TL2.1
CD282 (TLR2)
Yes
裂解全血, 淋巴细胞
2A9-1
CX3CR1
No
裂解全血, 淋巴细胞
K0124E1
CX3CR1
No
裂解全血
L243
HLA-DR
Yes
裂解全血
MHM-88
IgM
No


—— 小鼠样本 ——
 

实验样本
克隆号
标记物
是否适合固定
C57BL/6 小鼠脾脏
1B1
CD1d
No
C57BL/6 小鼠脾脏
17A2
CD3
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
145-2C11
CD3
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
RM4-5
CD4
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
GK1.5
CD4
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
RM4-4
CD4
No
C57BL/6 小鼠脾脏
53-7.3
CD5
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
53-6.7
CD8a
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
YTS156.7.7
CD8b
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
53-5.8
CD8b.2
No
C57BL/6 小鼠骨髓
M1/70
CD11b
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
N418
CD11c
No
C57BL/6 小鼠脾脏
93
CD16/32
No
C57BL/6 小鼠脾脏
6D5
CD19
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
7000000000
CD21/35
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
B3B4
CD23
No
C57BL/6 小鼠脾脏
M1/69
CD24
No
C57BL/6 小鼠脾脏
LG.3A10
CD27
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
37.51
CD28
No
C57BL/6 小鼠脾脏
HMβ1-1
CD29
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
MEC13.3
CD31
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
390
CD31
No
C57BL/6 小鼠脾脏
HM40-3
CD40
No
C57BL/6 小鼠脾脏
42817
CD40
No
C57BL/6 小鼠脾脏
IM7
CD44
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
30-F11
CD45
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
104
CD45.2
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
RA3-6B2
CD45R (B220)
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
HM48-1
CD48
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
HMα2
CD49b
No
C57BL/6 小鼠脾脏
MEL-14
CD62L
No
C57BL/6 小鼠骨髓
RI7217
CD71
No
C57BL/6 小鼠脾脏
EAT-2
CD81
No
C57BL/6 小鼠骨髓
20/70
CD88 (C5aR)
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
20000000
CD103
No
C57BL/6 小鼠骨髓
2B8
CD117 (c-kit)
No
C57BL/6 小鼠脾脏
TM-β1
CD122
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
A7R34
CD127 (IL-7Rα)
No
C57BL/6 小鼠骨髓
A2F10
CD135
No
C57BL/6 小鼠脾脏
281-2
CD138
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
12F12.2
CD150
No
C57BL/6 小鼠脾脏
CXCR3-173
CD183 (CXCR3)
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
29-2L17
CD196 (CCR6)
No
C57BL/6 小鼠脾脏
4B12
CD197 (CCR7)
No
C57BL/6 小鼠骨髓
NLDC-145
CD205 (DEC-205)
No
C57BL/6 小鼠脾脏
1B1.3a
CD210 (IL-10R)
No
C57BL/6 小鼠脾脏
10F.9G2
CD274
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
927
CD317
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
29A1.4
CD335
Yes
C57BL/6 小鼠骨髓
RB6-8C5
Gr1
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
AF6-88.5
H-2kb
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
M5/114.15.2
I-A/I-E
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
AF6-120.1
I-Ab
No
C57BL/6 小鼠脾脏
11-26c.2a
IgD
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
RMM-1
IgM
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
2F1/KLRG1
KLRG1 (MAFA)
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
DATK32
LPAM-1
No
C57BL/6 小鼠骨髓
HK1.4
Ly6C
Yes
C57BL/6 小鼠骨髓
1A8
Ly6G
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
PK136
NK1.1
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
E13-161.7
Sca-1 (Ly6A/E)
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
D7
Sca-1 (Ly6A/E)
Yes
C57BL/6 小鼠脾脏
551
Siglec H
No
C57BL/6 小鼠脾脏
H57-597
TCRβ
Yes
C57BL/6 小鼠骨髓
TER-119
TER-119
Yes


多聚甲醛染色后固定


染色后的固定,就与抗原构象关系不大了,更多的是荧光素。以前4色以内的时候,用的荧光素都是非串联的,因此大多数影响不大,但随着各种新型串联染料的出现,多聚甲醛固定就成了问题了。


事实上,当你去搜索串联染色标记(如PE-cy7、APC-cy7等)的抗体时,会发现一些比较详细的描述里面会注明,用多聚甲醛固定过的样本,必须在4小时内检测,否则容易导致串联染料降解,若要长时间保存,还是需要洗涤后,转移到不含多聚甲醛的缓冲液中。


需要注意的是,做GFP荧光检测的同学,也需要注意一下,多聚甲醛固定也会影响GFP,多聚甲醛固定后,并非使GFP荧光淬灭,而是使GFP蛋白构象发生改变,无法产生荧光。有时候你固定后检测到的荧光可能是自发荧光,或剩余的未被改变构象的GFP发出的。


解决方案


1、 如果检测的是前述表格中容易被多聚甲醛影响的分子,请尽量不要预固定,如需长期保存样本,可以考虑冻存单个核细胞
2、 如果检测的是前述表格中不会受多聚甲醛影响的分子,可用1%多聚甲醛固定保存,但FSC、SSC和荧光强度影响较大。
3、 如果希望在染色后保持较长时间荧光稳定,仍首选建议:避光、4度,如果仍不放心,可考虑购买商品化的适用于串联染料的专用固定剂。

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