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PCR常见问题分析及对策

点击次数:1457 次    更新时间:2017-08-17

PCR常见问题分析及对策


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PCR常见问题分析及对策

 


问题1:无扩增产物 ( 现象:正对照有条带,而样品则无)

原因:

1.模板:含有抑制物,含量低

2.Buffer对样品不合适

3.引物设计不当或者发生降解

4.反应条件:退火温度太高,延伸时间太短

对策:

1.纯化模板或者使用试剂盒提取模板DNA或加大模板的用量

2.更换Buffer或调整浓度

3.重新设计引物(避免链间二聚体和链内二级结构)或者换一管新引物

4.降低退火温度、延长延伸时间

 

问题2:非特异性扩增 现象:条带与预计的大小不一致或者非特异性扩增带 )

原因:

1.引物特异性差

2.模板或引物浓度过高

3.酶量过多

4.Mg2+浓度偏高

5.退火温度偏低

6.循环次数过多

对策:

1.重新设计引物或者使用巢式PCR

2.适当降低模板或引物浓度

3.适当减少酶量

4.降低镁离子浓度

5.适当提高退火温度或使用二阶段温度法

6.减少循环次数


问题3:拖尾  ( 现象:产物在凝胶上呈Smear状态。)

原因:

1.模板不纯

2.Buffer不合适

3.退火温度偏低

4.酶量过多

5.dNTP、Mg 2+浓度偏高

6.循环次数过多

对策:

1.纯化模板

2.更换Buffer

3.适当提高退火温度

4.适量用酶

5.适当降低dNTP和镁离子的浓度

6.减少循环次数


问题4:假阳性  ( 现象:空白对照出现目的扩增产物 )
原因:

靶序列或扩增产物 的交*污染

对策:

1.操作时应小心轻柔,防止将靶序列吸入加样枪内或溅出离心管外;

2.除酶及不能耐高温的物质外,所有试剂或器材均应高压消毒。所用离心管 及加样枪头等均应一次性使用。

3.各种试剂最好先进行分装,然后低温贮存 。



推荐一款试剂PCR Mix


此款试剂:

1、含有Taq酶和高保真酶,既保证扩增效率,又大大降低错配几率可同时满足短片段和长片段产物的扩增;

2、已混合好dNTP、Mg 2+、酶、缓冲液体系,加模板、引物稀释到合适体系就可,模板浓度、纯度不用太担心。

 
不同浓度模板用本试剂进行PCR扩增,
模板浓度高至20ng,低至0.16ng,
都能扩增出较好的条带。

模板浓度:1、20ng   2、4ng   3、0.8ng   4、0.16ng
 
目录号 规格 目录价
MR0301-1 1mL 180
MR0301-5 5mL 700