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ELISA标准曲线的绘制注意事项

点击次数:1518 次    更新时间:2017-08-17

ELISA标准曲线的绘制注意事项


ELISA标准曲线的绘制注意事项


一、做标准曲线样品检测时有几个问题需要注意:


1、样品的浓度等指标是根据标准曲线计算出来的,所以首先要把做标准曲线看作是比做正式实验还要重要的一件事,否则后面的实验结果无从谈起。


2、设置标准曲线样品的标准浓度范围要有一个比较大的跨度,并且要能涵盖你所要检测实验样品的浓度,即样品的浓度要在标准曲线浓度范围之内,包括上限和下限。而对于呈S型的标准曲线,尽量要使实验样品的浓度在中间坡度最陡段,即曲线几乎成直线的范围内。


3、最好采用倍比稀释法配制标准曲线中的标准样品浓度,这样就能够保证标准样品的浓度不会出现较大的偏离。


4、检测标准样品时,应按浓度递增顺序进行,以减少高浓度对低浓度的影响,提高准确性。


5、标准曲线的样品数一般为7个点,但至少要保证有5个点。


6、做出的标准曲线相关系数因实验要求不同而有所变动,但一般来说,相关系数R至少要大于0.98,对于有些实验,至少要0.99甚至是0.999.



二、选择什么方程去拟合

 

用于免疫检测的所谓“标准曲线"其实称为拟合曲线比较合适。免疫检测时标准点(可以是倍比稀释的,也可以不是)浓度如果和相应的吸光度(OD)值如果能够呈现直线关系当然是最理想的了,这时可以通过EXELL等方便的获得拟合曲线,进而推算出样品的浓度值。但我们做免疫检测很少有时候能够有这么理想的情况,标品浓度和相应OD值往往是"S"型的曲线关系,这时就不能用直线拟合的方式了,而对拟合方法进行选择就是必要的了。


关于标准曲线的拟合方式,直线、二次曲线、三次曲线、指数、对数等虽都可用于ELISA及其它生物学反应中的曲线拟合,但都只适用于曲线的一部分,有的适用于前半段,有的适用于后半段,有的适用于中间一段,而Logistic曲线则对曲线的全部都有较好的适用性。当然,如果用于定量,还是在中间一段较好。这些方法虽然没有一种方法可以通用,但也都可以用。关键在于你的标准曲线做到了S形的哪一部分,你想检测的样品浓度在曲线的哪一部分。在S曲线的低浓度部分可以用乘幂方程很好的拟合,中低浓度部分可以用直线方程,中间部分可用对数方程,而中后段可用四参数。


目前国际上最流行的免疫检测拟合方式是“四参数逻辑拟合",用这种拟合方式往往能够比较精确的反映浓度和吸光度的曲线关系,从而进一步比较正确的获得样品中待测物质的浓度值。


其实,在一个长的区间内,Logistic应该都能拟合得较为理想。但并不是说它就是万能的。事实上不仅是ELISA,其它很多生物学反应都是S形曲线,也都可以用Logistic曲线拟合。但建模型是一回事,而用它来定量是另一回事。如果用来定量,S形曲线的中间段(较陡处)是比较好的,而两端的平坦部分计算误差会大,有时甚至会很大。

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