表观遗传学系列之甲基化

甲基化是蛋白质和核酸的一种重要的修饰，调节基因的表达和关闭，与癌症、衰老、老年痴呆等许多疾病密切相关，是表观遗传学的重要研究内容之一。 最常见的甲基化修饰有DNA甲基化和组蛋白甲基化。

DNA甲基化即在DNA上增加甲基基团，是使基因的转录抑制或沉默的主要方式。该修饰特异性地发生在CpG位点，胞嘧啶通过磷酸盐与鸟苷酸连接(图1)。甲基基团的插入改变了DNA的表观和结构，可能会直接阻碍DNA的识别及与转录因子的结合，或者吸引其他因子优先与DNA结合，干扰转录因子的结合。目前已鉴定了三个与甲基化DNA结合的蛋白家族，包括MBD蛋白、Kaiso和Kaiso样蛋白、以及SRA蛋白。通过招募这些蛋白，DNA甲基化可促进某些组蛋白状态的维持，如去乙酰作用，从而保持转录后的组蛋白修饰。例如，MBD家族的甲基CpG结合蛋白2(MeCP2)与甲基CpG结合，招募HDACs，可促使染色体浓缩和转录抑制。
 

图1. DNA甲基化和去甲基化。DNMT3A和DNMT3B在CpG 二核苷酸的胞嘧啶处重新DNA甲基化。复制后，DNMT1 维持子链的甲基化。碱基切除修复机制在甲基化胞嘧啶 (5mC) 脱氨基后失去甲基化作用，导致T:S错配。

CpG位点被三种DNA甲基转移酶(DNMTs)中的一种甲基化。在胚胎形成期，重新甲基化由DNMT3A和DNMT3B调控，两者具有类似结构，由PWWP结构域、PHD样或ADD结构域，以及羧端催化域组成。PWWP结构域是DNMT3A和DNMT3B在体内与染色质结合所必需的。DNMT3L缺少了PWWP和功能性的催化域，可与DNMT3A或DNMT3B形成异二聚体，促发其重新开始的配体的活性，引导DNA的识别。DNMT3L的PHD结构域与组蛋白H3的N端作用，只在与未甲基化DNA结合时才被激活。合适的组蛋白修饰组合可为重新甲基化复合物的对接创造保护或许可的条件。SETD1在赖氨酸第4个残基(H3K4)的特异性甲基化则会抑制DNMT3L的结合。H3K4甲基化是活化基因的标志，并且启动子中的三甲基化H3K4和DNA甲基化之间呈负相关。的确大部分未甲基化CpGs的染色质富含H3K4二甲基化和三甲基化。某些印记基因的启动子要发生DNA甲基化则必须由组蛋白脱甲基酶LSD2(KDM1B)先将H3K4甲基化去除。此外，组蛋白H3的第36位赖氨酸(H3K36me3)的SETD2三甲基化促使DNMT3A结合，而H3K36me3脱甲基酶KDM2A与未甲基化CpGs结合可除去H3K36me3。

为了维持基因转录的活化或失活状态，胚胎发育期DNA甲基化模式严格地通过体细胞分裂进行拷贝。DNMT1表达于各种组织，负责维持CpG甲基化的细胞水平。在UHRF1指导下，其可识别半甲基化的DNA，并对复制时新合成的子链中的合适的胞嘧啶进行甲基化(图1)。CpG碱基配对可维持随后复制循环时的甲基化。CpG岛在多次的细胞分裂后仍稳定地保持了其总体的未甲基化状态(或可能的甲基化状态)，而DNMT1则发挥了部分作用。

在胚胎发育早期，性别决定后，为了重置生殖细胞的专一性，甲基化在整个基因组中被去除，然后在除了CpG岛以外重建。这保证了每一代的全能性更新，重新甲基化。在发育分化过程中，这些标记格外地在启动子或其他基因调控区域积累，抑制某些关键的多能性基因的转录。胚胎早期的去甲基化及随后的重新甲基化对决定体细胞DNA甲基化模式至关重要。一旦建立，体细胞DNA甲基化可遗传给子代，并仍会影响基因表达。甲基化被认为是长期相对稳定的特征，以维持细胞表型。在某些组织中，有明显的一部分CpG岛易于发生进行性甲基化以维持永久细胞系，重新甲基化也会发生在成熟的体细胞中，尤其是异常细胞如癌细胞。

在配子发生期、合子受精后，CpG去甲基化会发生在细胞重排中，保留诱导的多能性。该去甲基化过程需要胞苷脱氨酶和DNA修复机制(图1)。5-甲基胞嘧啶(5mC)的酶脱氨基作用会导致胸腺嘧啶和T:G碱基对错配。在表观遗传重排期间，碱基切除修复机制随后去除胸腺嘧啶，重新恢复C:G碱基配对。5mC的自发脱氨基作用也需要碱基切除修复机制来修复碱基错配。该过程在大多数分化的细胞中是无效的，但5mC的自发脱氨基作用会将所有的CpG二核苷酸序列去除。

最近发现胞嘧啶可被羟甲基化为5-羟甲基胞嘧啶(5-hmC)，从而证实了去甲基化的主动机制(图2)。5hmC破坏DNMTs的再甲基化，直到其被DNA修复，因此5hmC被认为是去除甲基化胞嘧啶的中间产物。三种不同的酶家族参与了主动去甲基化：10-11易位(TET)家族、激活诱导胞啶脱氨酶(AID)家族和碱基切除修复(BER) 转葡糖基酶家族。TET为羟基化物，氧化甲基化胞嘧啶使之催化5hmC。AID作用于特异性羟甲基位点，将5hmC脱氨基为尿嘧啶(5hmU)，最终通过胸腺嘧啶DNA糖基化酶(TDG)和单链选择性单功能尿嘧啶DNA糖苷酶1(SMUG1)被未甲基化胞嘧啶。
 

图2. 潜在的DNA去甲基化的主动和被动机制。被动的DNA 去甲基化在DNMTs活性降低或缺失时发生。主动DNA去甲基 化涉及三种不同的酶家族来修复DNA：(1)TET将5mC羟基化 形成5hMC；(2)AID将5mC(或5hmC)脱氨基形成5-胸腺嘧啶 (5mU)或5-羟基胸腺嘧啶(5hmU)；(3)TDG和SMUG1碱基切除 修复转葡糖基酶替代中间产物(5hmU)，最终替代胞嘧啶和 DNA去甲基化。

组蛋白甲基化是指发生在H3和H4组蛋白N端精氨酸Arg(R)或赖氨酸Lys(K)残基上的甲基化，由组蛋白甲基转移酶介导催化。其功能主要体现在异染色质形成、基因印记、X染色体失活和转录调控方面。

催化Arg甲基化的酶称为蛋白质精氨酸甲基转移酶(PRMT)家族，这类酶主要催化甲基从S-酰苷甲硫氨酸向精氨酸中的胍基氮转移。这一家族又可分为两类：第一类酶催化形成单甲基精氨酸和非对称的双甲基精氨酸；第二类酶催化形成单甲基精氨酸和对称的双甲基精氨酸。PRMT家族包括 PRMT1、PRMT3、RMT1/HMT1、PRMT4/CAMR1、PRMT5。其中只有PRMT5属于第二类，其余都属于第一类。通过对小鼠中PRMT3的晶体学研究发现这种酶有以下两大特征：(1)PRMT3的整个核心结构可分为两个区域：Adomet-binding结构域和Barrel-like结构域。(2)酶的活性位点位于两个区域形成的深沟中。在酵母中，对HMT1的晶体学研究也发现其单体结构与PRMT3的相似。这些结果显示尽管PRMT家族中的蛋白质各不相同，但它们可能都包含一个保守的催化核心区，并且用相似的机制催化底物，家族内各成员的不同可能表现在非保守区域。

催化Lys甲基化的酶很多都含有SET结构域。SET结构域是一个包含约110个氨基酸的基序，它是未知生化功能但与染色质紧密联系的蛋白质中的一部分，也是植物核酮糖二磷酸羧化酶-加氧酶中大亚基甲基转移酶(LSMTs)的一部分。Su(var)3-9是最早被发现催化赖氨酸的组蛋白甲基转移酶，它是果蝇中位置效应花斑(PEV)的抑制子。在哺乳动物中与Su(var)3-9类似的酶是SUV39H1和SUV39H2，在裂殖酵母中与Su(var)3-9类似的是Clr4。以上这4种酶只催化H3-K9甲基化，而哺乳动物中另一种甲基转移酶G9a不仅可以催化H3-K9甲基化，还可以催化H3-K27甲基化。最新发现能催化H3-K9甲基化的酶有SETDB1/ESET。另外，催化H3-K4的组蛋白甲基转移酶包括SET9和裂殖酵母中的SET1；还有一些组蛋白甲基转移酶，比如SET2只催化H3-K36、PR-SET7和 SET8催化H4-K20。

DNA和组蛋白甲基化均为动态的过程，需要持续的调控，对细胞信号转导或组织特异性分化具有重要的潜在作用。进一步了解DNA和组蛋白的甲基化和去甲基化的细微区别将会对防治癌症和其他人类疾病提供治疗策略。

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部分产品展示：

DNA Methylation EIA Kit (Cat No.589324) 稳定性：-20℃保存大于一年 灵敏度：50% B/B0 = 12ng/ml 检测下限：80% B/B0 = 3ng/ml 样本类型：血清、血浆、尿液、细胞培养物、细胞裂解物、组织样本  特异性：5-Methyl-2’-deoxycytidine 100% 5-Methylcytidine 20% 2-Deoxycytidine 0.1%   Cytidine 0.1%     Thymidine <0.01%

Methyltransferase Fluorometric Assay Kit (Cat No. 700150)  稳定性：-80℃保存大于6个月 检测范围：0 – 50 μM 激发波长：530 – 540 nm 检测波长：585 – 595 nm

SET7/9 Methyltransferase Inhibitor Screening Assay Kit (Cat No. 700270) 稳定性：-80℃保存大于6个月 精密度：板内差异 < 1.3% 板间差异 < 1.5%  激发波长：530 – 540 nm 检测波长：585 – 595 nm

5-Azacytidine (Cat No. 11164)  稳定性：-20℃保存大于两年 纯度：≥ 95% 5-Azacytidine为DNA甲基转移酶抑制剂，可降低与某些疾病相关的超甲基化， 包括骨髓增生异常综合征(体外抗骨髓瘤活性的IC50s = 2.4和2.6 μM)和癌 症(抑制多种肿瘤细胞系增殖的IC50s = ~ 0.4 μM)等。

EED (human recombinant) (Cat No. 10628)  全称：Embryonic Ectoderm Development 序列：1 – 441aa全长 分子量：53.5 kDa  来源：杆状病毒表达载体于Sf21细胞中表达，带6 × His标签 纯度：≥ 95%  稳定性：-80℃保存大于9个月

SET7/9 Polyclonal Antibody (Cat No. 13731)  稳定性：-20℃保存大于一年 抗原：人SET7/9氨基酸131 – 145和336 - 352 宿主：兔 交叉反应性：人、小鼠  应用：WB