焦磷酸测序技术（Pyrosequencing）是针对序列的检测技术，能够快速精确地对序列变异进行定量。简化的操作步骤、分析的灵活性和理想的输出数据使焦磷酸测序技术为大通量、低成本、直观地进行单核苷酸多态性（SNPs）研究和临床检验提供了非常理想的技术操作平台。

焦磷酸测序原理

步骤1

扩增DNA片段并对焦磷酸模板链进行生物素化。通过变性，分离生物素化的单链PCR扩增子并使其与一条测序引物进行杂交。

步骤2

将杂交引物和单链模板与DNA聚合酶、ATP硫酸化酶、荧光素酶和腺苷三磷酸双磷酸酶，以及底物腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）和荧光素共孵育。

步骤3

第一个脱氧核苷酸三磷酸（dNTP）被引入反应。DNA聚合酶催化dNTP，使其在互补模板链的情况下对测序引物进行延伸。每个核苷酸的添加都对应着等摩尔数焦磷酸（PPi）的释放。

步骤4

ATP硫酸化酶在腺苷-5'-磷酸硫酸酐（APS）存在的情况下将PPi转化为ATP。生成的ATP为荧光素酶介导的荧光素氧化反应提供能量，并生成与ATP的数量成比例的可见光。电荷耦合器（CCD）摄像头检测到荧光素酶催化反应所生成的光，并将其作为原始输出数据中的一个峰值（热解图Pyrogram）。每个峰值（光信号）的高度与核苷酸结合的数目呈比例关系。

步骤5

腺苷三磷酸双磷酸酶是核苷酸的降解酶，持续地对未结合的核苷酸和ATP进行分解。当分解完成时，便会引入另一个核苷酸。

步骤6
dNTP的添加反应在持续进行着。应注意脱氧腺苷三磷酸α-硫代三磷酸（dATPαS）能够作者为天然脱氧腺苷三磷酸（dATP）的替代物，被DNA聚合酶有效利用，却并不会被荧光素酶所识别。当反应进行时，逐渐合成了互补的DNA链，其核苷酸序列能够凭借热解图（Pyrogram）轨迹中的信号峰值来确定。

强大的PyroMark平台与表观遗传和遗传分析流程无缝接合，一次检测可多达96个样本。可检测病原体中药物抗性的发展，基因表达调控中表观遗传学DNA甲基化的作用、牲畜的特异表型的遗传标记，以及法医检材样本中线粒体DNA的多态性。其与QIAGEN先进的样本制备、亚硫酸氢盐转化和PCR扩增技术兼容。借助于高度可靠的仪器可在序列水平上对SNP、插入和缺失、CpG位点进行检测以及生成序列信息，简化的工作流程可更快速地获得结果。

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