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LncRNA调控机制及研究策略

点击次数:1514 次    更新时间:2017-06-20

LncRNA调控机制及研究策略


LncRNA调控机制及研究策略


长链非编码RNA(long noncoding RNAs,LncRNAs)是一类转录本长度超过200nt的功能性RNA分子,其表达水平相对于蛋白编码基因较低,它们并不编码蛋白,而是以RNA的形式在多种层面上(表观遗传调控、转录调控以及转录后调控等)调控基因的表达水平。研究表明:LncRNAs在X染色体沉默、基因组印迹、染色体修饰、转录激活、转录干扰以及核内运输等方面具有重要的功能。其主要的调控机制如图1所示:

1. LncRNA的调控机制


根据所发现的lncRNA的作用机制,lncRNA主要可能具有以下几个方面的功能:

1)通过在蛋白编码基因上游启动子区(桔)发生转录,干扰下游基因(蓝)的表达(如酵母中的SER3基因)。

2)通过抑制RNA聚合酶II或者介导染色质重构以及组蛋白修饰,影响下游基因 (蓝)表达(如小鼠中的p15AS)。

3)通过与蛋白编码基因的转录本形成互补双链(紫),进而干扰mRNA的剪切,从而产生不同的剪切形式。

4)通过与 蛋白编码基因的转录本形成互补双链(紫),进一步在Dicer酶作用下产生内源性的siRNA,调控基因的表达水平。

5)通过结合到特定蛋白质上,lncRNA转录本(绿)能够调节相应蛋白的活性。

6)作为结构组分与蛋白质形成核酸蛋白质复合体。

7)通过结合到特定蛋白上,改变该蛋白的胞质定位。

8)作为小分子RNA,如miRNA,piRNA的前体分子。

 
2. LncRNA的研究策略
 

LncRNA的一般研究策略如图2所示,其过程主要包括LncRNA筛选、LncRNA确定、表达分析、功能研究和表达调控。

1) LncRNA筛选

通过lncRNA芯片或RNA-seq等方法对多对疾病模型和对照样本组织进行lncRNA表达谱分析;通过生物信息学的方法筛选出具有表达差异的lncRNA,构建共表达网络,预测lncRNA的靶基因;通过PCR或Northern Blot技术对候选lncRNA验证,确定其表达差异。QIAGEN RT2 lncRNA PCR Array通过实时定量PCR技术,可同时对多个与信号转导及疾病机制相关的lncRNA的表达进行集成式筛选,为研究者提供灵敏而特异的lncRNA表达谱分析。也可用于对RNA-seq及芯片研究结果的验证。

 

(2) LncRNA全长克隆

可以通过5' RACE获取lncRNA 5'全长,3' RACE获取lncRNA 3'全长,最终获取完整的lncRNA序列。

 

(3) 表达分析

细胞水平表达:在细胞水平进行检测表达差异。

组织分布:检测不同组织、不同阶段表达特性。

表达水平动力学变化:比较不同处理条件下,如药物处理、诱导处理下,表达水平差异。

 

(4) 功能研究

功能获得性研究:构建lncRNA过表达载体。

功能缺失性研究:可通过siRNA、shRNA、反义核酸等方法沉默lncRNA,干预lncRNA后检测其对疾病相关基因表达影响和对细胞表型如增殖、凋亡、侵袭、转移等的影响。

可通过RNA pull down、RNA-RIP、ChIRP-seq等方法检测与lncRNA结合的DNA、RNA、蛋白质。


(5) 表达调控:将lncRNA表达与其他领域相结合,解释lncRNA调控机理。

转录因子:研究lncRNA与转录因子的调控机制。

染色质重塑:lncRNA表观调控。

ceRNA机制:研究lncRNA-miRNA-mRNA三者之间的调控机制。

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