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测序专题——微生物多样性测序

点击次数:1293 次    更新时间:2017-07-07

测序专题——微生物多样性测序


测序专题——微生物多样性测序


在地球各种生境中,微生物表现出极大的多样性。然而由于纯培养法培养微生物的限制性,绝大多数种类的微生物并未得到了解。有数据表明,各种生境中大约只有1%的微生物是可培养的,多达99%的微生物在现有的实验条件和技术下尚未得到纯培养。从国内外目前采用的方法来看大致包括以下几类:传统的微生物平板纯培养法、DGGE/TGGE/TTGE、T-RFLP、SSCP、FISH、印记杂交、定量PCR、基因芯片、高通量测序等分子生物学方法。


微生物多样性测序是基于二代高通量技术对16S rDNA/18S rDNA/ITS等基因序列进行测序,能同时对样品中的优势物种、稀有物种以及一些未知的物种进行检测,获得样品中的微生物群落组成以及它们之间的相对丰度。具有低成本、高通量、流程自动化等优势。


哪些研究需求可以做微生物多样性测序


(1) 物种丰度值检测:

► 检测环境样本中的优势物种

► 检测环境样本中的稀有物种

► 检测特定的感兴趣的物种


(2) 不同分组样品相似性比较:

► 样本间的相似性聚类

► 不同来源的样本的差异性比较


(3) 寻找不同分组间的重要的Biomaker

► 统计分析寻找出引起不同分组差异的重要的微生物

► 寻找潜在的微生物之间的关联性


(4) 其它的可与微生物多样性相关的分析

► 外部环境的变化必然会带来微生物群落的变化,环境因子会带来哪些菌属的丰度变化,这些菌属(可能是有益菌、有害菌、功能菌)又给环境个体带来怎样的影响,这些均可做微生物多样性的检测。


测序区段选择


由于16S rDNA较长(1.5kb),我们只能对其中经常变化的区域也就是可变区进行测序。16S rDNA包含有9个可变区,分别是V1-V9。一般我们对V3-V4双可变区域进行扩增和测序,也有对V1-V3区进行扩增测序。
 

 16S rDNA全长


引物序列选择

对于微生物多样性测序,建议选择如下扩增引物:

5' fd1: AGAGTTTGATCCTGGCTCAG 8-27

3' rp2: AAGGAGGTGATCCAGCCGCA 1522-1541


测序平台选择

16S rDNA测序目前可以采用多种不同的测序仪进行测序,包括罗氏的454,Illumina的MiSeq,Life的PGM或Pacbio的RSII三代测序仪。不同的仪器各有优缺点,目前最主流的是Illumina公司的MiSeq,因为其在通量、长度和价格三者之间最为平衡。MiSeq测序仪可以产生2×300 bp的测序读长,一次可以产生15 Gb的测序数据远远大于其他测序仪的测序通量。

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